جداسازی ژن پروتئین پوششی با rt-pcr از گیاهان آلوده به ویروس وای سیب زمینی و بیان آن در باکتری escherichia coli

سیب زمینیs.tuberosum گیاه یک ساله علفی دو لپه ای می باشد و در مناطقی که غده ها بتوانند در بین فصول زراعی بقا یابند به صورت چند ساله رشد کرده و به عنوان یک گیاه صنعتی و پر درآمد بصورت جهانی کشت می شود. خاستگاه این گیاه کوه های آند آمریکایی جنوبی می باشد، جایی که سیب زمینی یکی از ارکان رژیم غذایی میلیون ها نفر از افراد بومی می باشد. امروزه سیب زمینی غالبا برای مصارف انسانی کشت می شود، و در طول تنها چهار قرن اخیر، سیب زمینی بعد از برنج، گندم و ذرت، تبدیل به چهارمین محصول غذایی بزرگ در سطح جهان شده است. چین بزرگترین تولید کننده آن بوده و فدراسیون روسیه، ایالات متحده آمریکا و لهستان به ترتیب در رتبه های بعدی قرار گرفته اند (خانیزاد و همکاران، 1389). سازمان خواربار و کشاورزی ملل متحد (فائو) تولید سیب زمینی ایران را در سال 2010 رقمی معادل چهار میلیون و 54 هزار تن تخمین زده است. بر این اساس، ایران رتبه پانزدهم را در جدول بزرگ ترین کشور های تولیدکننده سیب زمینی از نظر میزان تولید به خود اختصاص داده است. بیماری های ویروسی در طول قرن گذشته نقش مهمی را در کاهش توسعه صنعت سیب-زمینی بازی کرده اند به طوری که حداقل 37 گونه ی ویروسی به صورت طبیعی موجب آلودگی سیب-زمینی می شود که potato virus y یکی از مهم ترین آن ها بوده و دارای پراکنش جهانی است، در ایران نیز این ویروس از استان های اصفهان، خراسان، اردبیل، همدان و آذربایجان شرقی گزارش شده است (قاسم زاده و همکاران. 1389). علایم آن روی گیاهان سیب زمینی بسته به نژاد ویروس و رقم سیب-زمینی از موزاییک خفیف گرفته تا نکروز شدید شاخ و برگ و حتی مرگ گیاهان آلوده متغیر است. انتشار با شته های ناقل به عنوان یکی از مهم ترین راههای انتقال طبیعی ویروس در مزرعه است هر چند که این ویروس به صورت مکانیکی و از طریق تماس شاخ و برگ یا غده بین گیاهان انتشار پیدا می کند. ویروس yسیب زمینی از جهت ایجاد علایم روی گیاهان مختلف و از جهت پاسخ سرولوژیک به آنتی بادی های مونوکلونال به 3 گروه تقسیم می شوند: استرین n در توتون باعث ایجاد کلروز در رگبرگ ها می گردد و در سیب زمینی علایم خفیفی ایجاد می کند. از این گروه نژاد ntn در اروپا در سال های اخیر شناسایی شده است. نژاد cدر برخی ارقام سیب زمینی باعث موزاییک سیستمیک و خطوط نقطه چین در برگ ها می شود، نژاد o در برگ های توتون باعث موزاییک و پیسک و در سیب زمینی باعث پیسک یا موزاییک شدید و افتادگی برگ ها می شود. خسارت ناشی از این ویروس بسته به نژاد آن ممکن است به صورت موزاییک, پیسک, زخم, کوتولگی و نکروز باشد (خانیزاد و همکاران، 1389). روش های سرولوژیک به عنوان یکی از متداول ترین روش های ردیابی ویروس های بیماری زای گیاهی مورد استفاده قرار می گیرند به دلیل اینکه نسبت به سایر روش ها نیاز کمتری به زمان و امکانات دارند. برای انجام این روش ها (سرولوژیک) نیاز به آنتی بادی ویژه ی ویروس می باشد که، معمولا به روش سنتی برای تولید این آنتی بادی ها از پیکره های خالص سازی شده ی ویروس استفاده می شود. با توجه به مشکلاتی که این روش دارد، مثلا این روش نیازمند زمان و هزینه ی بیشتر و امکانات مخصوص مانند التراسانتریفوژ است که در همه ی آزمایشگاه ها وجود ندارد. همچنین، قیمت آنتی بادی های تجارتی ویروس ها زیاد و برخی از ویروس های گیاهی در گیاه دارای غلظت کمی بوده و در حین مراحل خالص سازی ناپایدارند بنابراین، به نظر می رسد که استفاده از پروتئین های نوترکیب ویروسی از جمله بیان پروتئین پوششی برای تهیه-ی آنتی بادی های نوترکیب می تواند این مشکلات را مرتفع سازد. در راستای تولید چنین پروتئین های نوترکیب، بایستی آن ها را در سیستمی مانند سیستم پروکاریوتی بیان کرد. در این تحقیق، از بیان ژن پروتئین پوششی این ویروس در باکتری escherichia coli به جای خالص سازی ذرّات ویروسی به منظور تهیه ی آنتی بادی چند همسانه ای علیه نژادهای pvy، استفاده شد. پس از بیان ژن مورد نظر، بیان آن با استفاده از آزمون های مثل sds-page و وسترن بلاتینگ ، مورد بررسی قرار گرفت که نتایج به دست آمده حاکی از بیان این پروتئین نوترکیب بود.